Komplet za otkrivanje staničnog ciklusa i apoptoze

 

Naziv proizvoda	Kat.br	spec.
Komplet za otkrivanje staničnog ciklusa i apoptoze	G1700-50T	50 T

 

 

Stanični ciklus odnosi se na cijeli proces stanice od završetka jedne diobe do kraja sljedeće diobe, koji se uglavnom dijeli na dvije faze: intermitotsku fazu i mitotičku fazu (M faza). Međustanična faza uglavnom se sastoji od rane faze sinteze DNA (G1 faza), kasne faze sinteze DNA (S faza) i kasne faze sinteze DNA (G2 faza). Redoslijed cijelog staničnog ciklusa može se izraziti kao G1→S→G2→M. Prije svega, u G1 fazi stanice uglavnom sintetiziraju RNK i proteine ​​kako bi pripremile materijale i energiju za ulazak stanica u S fazu. Zatim ulazi u S fazu: stanice počinju sintetizirati DNA i nešto histona i drugih tvari, a sadržaj stanične DNA počinje rasti. Konačno, G2 faza: u ovom trenutku, sadržaj DNK u stanici postao je dvostruko veći od G1 faze, i zaustavio je replikaciju DNK, da bi ušao u fazu mitoze kako bi izvršio mnogo sinteze proteina i drugog materijala; Ako je stanica u fazi G0(stanice se privremeno prestaju dijeliti, diferencirati i mirovati)/G1, sadržaj DNK u stanici je 1N; Dakle, stanice u G2 imaju 2N DNA; Sadržaj DNA stanica S-faze između G1 i G2 bio je između 1N i 2N. U apoptotskim stanicama jezgra će se koncentrirati i doći će do fragmentacije DNA, što dovodi do gubitka dijela fragmenata genomske DNA, pa je sadržaj DNA manji od 1N, a tzv. sub-G1 vrh, odnosno vrh apoptotične stanice , pojavljuje se na karti fluorescencije otkrivenoj protočnom citometrijom. Stoga se o staničnom ciklusu i stanju može suditi prema sadržaju stanične DNA.

 

Apoptoza se također može detektirati promatranjem promjena u staničnom raspršenju svjetla protočnom citometrijom. Kada dođe do apoptoze, citoplazma i kromatin se koncentriraju, a jezgra se fragmentira, što rezultira apoptoznim tjelešcima. Kromatin se smanjuje, a gustoća stanica raste u fazi prije apoptoze. U kasnoj fazi apoptoze, stanice proizvode apoptotička tijela, a raspršenje svjetlosti stanica se mijenja.

 

Komplet za analizu staničnog ciklusa i apoptoze koristio je klasičnu metodu bojenja propidijem za otkrivanje i analizu staničnog ciklusa i apoptoze. Propidij jodid se može ugraditi u dvolančanu DNK i uzrokovati njezinu fluoresciju. Ciklus i stanje stanice mogu se razlikovati po tome što je intenzitet fluorescencije proporcionalan sadržaju dvolančane DNA i pravilnoj promjeni sadržaja DNA u različitim staničnim ciklusima. Ovaj se komplet može koristiti za detekciju staničnog ciklusa i apoptoze stanica tkiva, adherentnih ili suspendiranih stanica (ako se koristi za detekciju staničnog ciklusa i apoptoze tkiva, tkivo se mora probaviti u stanje jedne stanice prije detekcije).

 

 

Prijevoz s mokrim ledom ; Čuvati na -20 stupnjeva daleko od svjetlosti, pufer za bojenje može se čuvati na 4 stupnja; Vrijedi 12 mjeseci.

 

 

komponentaBroj	komponenta	G1700-50T
G1700-1	PI otopina za bojenje (50×)	500 μL
G1700-2	RNaza A (50×)	500 μL
G1700-3	Pufer za bojenje	25 mL
Priručnik s uputama		1 kom

 

 

1. Medij za kulturu stanica koji sadrži serum;

2. Otopina za probavu tripsina (preporučuje se G4001);

3. PBS pufer (preporučuje se G4202);

4. 75% etanol.

 

 

1. Priprema uzoraka stanica (broj stanica se kontrolira na1×105~1 ×106)

1.1. Za adhezivne stanice:uklonite medij kulture, dodajte otopinu za probavu tripsina kako biste probavili stanice i promatrajte pod mikroskopom da stanice postaju okrugle i labave. Digestija je prekinuta dodavanjem odgovarajuće količine staničnog medija koji je sadržavao serum, a stanice su lagano otpuhane kako bi se napravila suspenzija. Suspenzija je prebačena u epruvetu za centrifugiranje, centrifugirana na 1000 g 3-5 min, a supernatant je odbačen da zadrži talog stanica. Zatim je precipitacija stanica isprana 1-2 puta s prethodno ohlađenim PBS puferom, a supernatant je odbačen centrifugiranjem na isti način kako bi se zadržala precipitacija stanica.

1.2. Za suspendirane stanice:prenesite stanice u epruvetu za centrifugiranje, centrifugirajte na 1000 g 3-5 min, odbacite supernatant i zadržite stanični talog; Zatim je precipitacija stanica isprana 1-2 puta s prethodno ohlađenim PBS puferom, a supernatant je odbačen centrifugiranjem na isti način kako bi se zadržala precipitacija stanica.

1.3. Za stanice tkiva:Maramicu narežite na što sitnije komade. Prema izvoru tkiva, blok tkiva je probavljen pomoću tripsina, kolagenaze i drugih probavnih enzima, a suspenzija pojedinačnih stanica dobivena je filtriranjem kroz 100-300 mrežasto sito. Filtrirana stanična suspenzija je prebačena u epruvetu za centrifugiranje, centrifugirana na 1000 g 3-5 min, a supernatant je odbačen kako bi se zadržao stanični talog. Zatim je precipitacija stanica isprana 1-2 puta s prethodno ohlađenim PBS puferom, a supernatant je odbačen centrifugiranjem na isti način kako bi se zadržala precipitacija stanica.

 

2. Fiksacija uzoraka stanica

2.1. Dodajte 1 mL 75% etanola prethodno ohlađenog na ledu sakupljenom uzorku stanične precipitacije i lagano otpuhnite stanice kako bi se temeljito izmiješale;

2.2. Stanice su fiksirane na 4 stupnja 30 minuta ili dulje (obično 2 sata ili više može jamčiti učinak bojenja, a 12-24 h može biti bolje za poboljšanje učinka bojenja).

2.3. Nakon fiksiranja na određeno vrijeme, stanice su centrifugirane na 1000 g 3-5 min kako bi se uklonila otopina za fiksiranje etanolom i zadržao stanični precipitat;

2.4. Dodirnite dno epruvete za centrifugiranje kako biste raspršili stanice, resuspendirali i isprali stanice s PBS puferom, centrifugirali na 1000 g 3-5 min i bacili supernatant kako bi prikupili talog stanica;

 

3. Priprema i bojenjeof Radna otopina

3.1. Prema sljedećoj tablici, otopina za bojenje može se pripremiti izvan svjetla, a količina se može povećati ili smanjiti u jednakom omjeru prema zahtjevima upotrebe (pripremljena otopina za bojenje može se čuvati na 4 stupnja u kratkom vremenu, molimo koristite u roku od istog dana);

 

	1 uzorak	5Uzoraks	10 uzoraka
Pufer za bojenje	480 μL	2,4 mL	4,8 mL
PI mrlja (50×)	10 μL	50 μL	100 μL
RNAseA (50×)	10 μL	50 μL	100 μL
Ukupni volumen	500 μL	2,5 mL	5 mL

 

3.2. Lupnite po dnu epruvete za centrifugiranje kako biste raspršili stanice istaložene u koraku 2.4, zatim dodajte 500 μL pripremljene radne otopine za bojenje i lagano puhnite kako biste raspršili stanice i pomiješali s radnom otopinom za bojenje;

3.3. Nakon inkubacije na 37 stupnjeva tijekom 30 minuta u mraku, za detekciju se može koristiti protočna citometrija.

 

4. Detekcija protokaand Analiza

Crvena fluorescencija detektirana je protočnom citometrijom na valnoj duljini ekscitacije od 488 nm, a detektirano je i raspršenje svjetlosti. Analiza sadržaja stanične DNA i analiza raspršenja svjetlosti provedene su pomoću odgovarajućeg softvera za analizu.

 

 

1. Sve fluorescentne boje imaju problem gašenja fluorescencije, stoga pokušajte izbjegavati svjetlost tijekom upotrebe i skladištenja.

2. Prije eksperimenta predlaže se sinkronizacija staničnog ciklusa kako bi se izbjegle velike razlike u reproduktivnosti uzrokovane različitim staničnim ciklusima.

3. Gustoća sadnje pokusnih stanica ne smije biti previsoka ili preniska kako bi se spriječila inhibicija kontakta ili ovisnost o gustoći.

4. Obratite pozornost na zaštitu tijekom rada s otopinom za bojenje PI, izbjegavajte izravan kontakt s ljudskim tijelom ili udisanje.

5. Radi vaše sigurnosti i zdravlja, nosite laboratorijsku kutu i jednokratne rukavice tijekom rada.

 

Samo za istraživačku upotrebu!

 

 

Popularni tagovi: komplet za otkrivanje staničnog ciklusa i apoptoze, proizvođači, dobavljači, tvornica kompleta za otkrivanje staničnog ciklusa i apoptoze u Kini