Coomassie (Bradford) komplet za kvantitativno ispitivanje proteina

Dvije najčešće korištene metode za kvantificiranje koncentracije proteina su Bradfordova metoda i BCA metoda. Princip Bradfordove metode temelji se na brzom vezanju Coomassie brilliant blue G250 na proteine. Maksimalna apsorpcija Coomassie Brilliant Blue G25{{10}} je 488 nm u slobodnom stanju. Nakon vezanja na protein, maksimalna apsorpcija se promijenila na 595 nm. a vrijednost apsorpcije svjetla proporcionalna je sadržaju proteina, pa se može koristiti za kvantitativnu detekciju proteina. Ova metoda određuje koncentracije proteina neovisno o kemikalijama u velikoj većini uzoraka, koje mogu biti visoke do 1 mM za -merkaptoetanol i 5 mM za ditiotreitol; Međutim, pod utjecajem malo viših koncentracija sredstava za uklanjanje kamenca, potrebno je osigurati da sadržaj SDS-a bude manji od 0,01%, sadržaj Triton X-100 manji od 0,05%, a Tween-20, Sadržaj Tween-60, Tween-80 itd. manji je od 0,015%. Komplet za kvantitativno otkrivanje BCA proteina (G2026) koji proizvodi naša tvrtka preporučuje se za uzorke koji sadrže sredstva za uklanjanje kamenca.

Ovim se kompletom lako i brzo rukuje, s visokom osjetljivošću i iznimno velikom brzinom otkrivanja, a može otkriti koncentracije proteina u rasponu od 25-1000 ug/mL.

Proizvod se isporučuje na sobnoj temperaturi. Standardne ampule goveđeg serumskog albumina (BSA) pohranjene na 4 stupnja, valjane 12 mjeseci. Standardna otopina proteina, pripremljena sa standardnim ampulama BSA i razrjeđenjem standardnih ampula, čuvajte na -20 stupnjeva i upotrijebite unutar 6 mjeseci.

1. Priprema standardne temeljne otopine proteina:Razrijedite 25 mg standardnih ampula goveđeg serumskog albumina (BSA) u 1 mL standardne ampule za razrjeđenje; Koncentracija standardne osnovne otopine proteina je 25 mg/mL i treba je čuvati na -20 stupnjeva.

2. Priprema standardne radne otopine proteina:Odgovarajuća količina od 25 mg/mL standardne temeljne otopine proteina razrijedi se 50 puta s PBS-om ili normalnom fiziološkom otopinom kako bi se dobila standardna radna otopina proteina s konačnom koncentracijom od 0,5 mg/mL. Pazite da razrijedite prema metodi 10-fold gradijenta kako biste osigurali točno razrjeđivanje.

3. Priprema standardne krivulje (metoda čitača mikropločica):Standardna radna otopina proteina dodaje se u {{0}}ploču s jažicama u 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 μL, a zatim PBS ili normalna fiziološka otopina dodaje se u istu 96-ploču s jažicama naizmjence na 20, 19, 18, 16, 12, 8, 4, 0 μL kako bi se nadoknadio iznad gradijenta radne otopine do 20 μL. Koncentracije proteina gradijentnih krivulja su 0, 25, 50, 100, 200, 300, 400 i 500 ug/mL.

4. Priprema uzorka:Razrijedite uzorak koji se ispituje na odgovarajući način (predeksperimentalnom detekcijom, koncentracija proteina u uzorku može biti unutar raspona standardne krivulje kako bi se osigurala pouzdanost rezultata testa). Dodajte 20 μL uzoraka u 96-ploču s jažicama. Uzorak koji se ispituje i standard proteina razrijede se istom otopinom.

5. Protokol epruvete:

a) Dodajte 200 μL Coomassie G-250 boje u svaku epruvetu i dobro promiješajte (96-ploča s jažicama može se tresti na vorteksu 30 s).

b) Inkubirajte uzorke 3-5 minuta na sobnoj temperaturi (RT).

c) Standardna krivulja br. 0 korištena je kao referenca i kolorimetrijski izmjerena na 595 nm, a zabilježena je vrijednost apsorbancije svake jažice.

d) Izračun: Uzmite gradijent sadržaja proteina (ug/mL) u standardnoj krivulji kao vodoravnu koordinatu i vrijednost apsorbancije kao okomitu koordinatu i iscrtajte standardnu ​​krivulju. Prema vrijednosti apsorbancije izmjerenog uzorka, koncentracija proteina (ug/mL) uzorka koji se testira u odgovarajućim jažicama može se pronaći na standardnoj krivulji, a zatim pomnožiti s razrjeđenjem uzorka koji je stvarni protein koncentracija uzorka koji se ispituje.

e) Također: ako se mjeri spektrofotometrom, promijenite standardni reakcijski volumen gradijenta na 1 mL u koraku 3. Dodajte 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mL standardne radne otopine proteina (koncentracija 0.5 mg/mL) u 7 čistih staklenih epruveta ili kolorimetrijskih epruveta, zatim dodajte 1.0, 0.95, 0.9, {{28 }}.8, {{30}}.6, 0.4, 0.2, 0 mL PBS-a ili fiziološke otopine u svaku epruvetu redom, i zatim dopunite gradijent radne otopine do 1 mL. Radna otopina gradijenta je dopunjena do 1 mL, a svaka epruveta je temeljito promiješana da se dobije krivulja gradijenta s koncentracijama proteina od 0, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 ug/mL.

f) Uzorci proteina koji će se testirati prikladno su razrijeđeni i dodani u nove staklene epruvete ili kolorimetrijske epruvete s volumenom uzorka od 1 ml.

g) Dodajte 3 mL boje Coomassie G-250 u svaku od gornjih epruveta s gradijentom standardne krivulje i epruveta s uzorkom, dobro promiješajte i ostavite 3-5 min na sobnoj temperaturi za kolorimetrijsku detekciju spektrofotometrom.

h) Valna duljina fotometra postavljena je na 595 nm tijekom detekcije, a standardna krivulja i uzorak koji se testira detektirani su s cijevi standardne krivulje br. 0 kao referencom za podešavanje nule. Nacrtajte standardnu ​​krivulju i izračunajte koncentraciju proteina u uzorku koji se ispituje prema metodi iz koraka 6.

1. Coomassie G-250 boju treba dovesti na sobnu temperaturu i pomiješati naopako prije upotrebe kako bi se izbjegao utjecaj na osjetljivost testa.

2. Kada pripremate standardnu ​​temeljnu otopinu proteina, provjerite je li dobro otopljena. Preporučuje se razrjeđivanje standardne radne otopine proteina u 10-strukom gradijentu, nemojte razrjeđivati ​​50 puta odjednom kako biste izbjegli velike pogreške.

3. Molimo nosite zaštitne naočale, rukavice ili zaštitnu odjeću.

Samo za istraživačku upotrebu!

Popularni tagovi: coomassie (bradford) pribor za kvantitativno ispitivanje proteina, Kina coomassie (bradford) komplet za kvantitativno ispitivanje proteina proizvođači, dobavljači, tvornica