U eksperimentima Western blot (WB), uklanjanje antitijela uglavnom se koristi u sljedećim scenarijima, ovisno o eksperimentalnim potrebama i svojstvima antitijela:
1. Otkrivanje više ciljeva na istoj membrani
Kada je količina uzorka ograničena ili su potrebni dosljedni uvjeti otkrivanja, uklanjanje omogućava ponovnu upotrebu membrane. Primjeri uključuju:
1) Sekvencijalno otkrivanje različitih ciljeva:Prvo otkrijete proteine s malim obiljem, a zatim tražite i otkrivaju one velike obižbe kako biste izbjegli nepotpuno uklanjanje.
2) Validacija s više markira:Na primjer, otkrivanje proteina u istom signalnom putu (npr. Fosforilirani i ukupni proteini). Prvo inkubirajte s fosfo-antitijelom, a zatim prikojte i sondi za ukupni protein kako biste osigurali usporedivost podataka.
2. Optimiziranje inkubacije antitijela ili provjera specifičnosti
1) Isključite nespecifično vezanje:Ako se pojave neočekivani pojasevi, skidanje i ukor s drugim antitijelom može pomoći u potvrdi unakrsne reaktivnosti.
2) Podesite redoslijed antitijela:Prvo otkrijte slaba ili lako oduzeta antitijela, nakon čega slijede jači.
3. Ušteda uzorka i vremena
1) Ograničena dostupnost uzorka:Za rijetke ili dragocjene uzorke (npr. Kliničke ili primarne stanice), ponovno korištenje membrane smanjuje upotrebu uzorka.
2) Brži eksperimentalni zaokret:Skidanje je brže od preuređenja gela i prijenosa, idealno tijekom optimizacije.
4. Posebne eksperimentalne potrebe
1) Umetanje korekcije upravljanja:Otkrivanje ciljanih i referentnih proteina uzastopno na istoj membrani kako bi se izbjegla varijacija šarže.
2) Blokiranje podešavanja:Ako BSA naruši učinkovitost uklanjanja, prebacite se na brzi blokator ServiceBio-a bez proteina ili Skim mlijeko kako biste poboljšali rezultate.
Bilješke:
Ograničenje uklanjanja:Membrana se obično može ukloniti 3–4 puta; Prekomjerno uklanjanje može rezultirati gubitkom proteina.
Provjera učinkovitosti:Uvijek provjerite uklanjanje antitijela otkrivanjem ECL -a kako biste izbjegli lažne pozitivne rezultate.
Ukratko, skidanje antitijela idealno je za otkrivanje više cilja, validaciju rezultata i očuvanje uzoraka. Odaberite uvjete uklanjanja na temelju vašeg eksperimenta i svojstava antitijela.
PreporučujemoServiceBio pufer za uklanjanje antitijelaZa sigurno i učinkovito uklanjanje primarnih i sekundarnih antitijela iz PVDF ili NC membrane:
G2078(Redovito): Za slabe signale ili antitijela s niskim afinitetom.
G2079(Poboljšano): Za jake signale ili antitijela visokog afiniteta.
